滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學者要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，**少它的表面都是有菌的。依此觀點，無菌室等未處理的地方、超凈臺的表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。
     這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。菌的特點是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時不有，無孔不入。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。
     無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理或化學的滅菌方法處理后的物體（當然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的），高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強酸強堿，化學元素滅菌劑等表面和內(nèi)部都是無菌的。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小的多。
     滅菌是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不會完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴格滅菌的操作空間（接種、超凈臺等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進行的操作，就叫做無菌操作。
     植物組織培養(yǎng)對無菌條件的要求是非常嚴格的，甚**超過微生物的培養(yǎng)要求，這是因為培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)，稍不小心就引起雜菌污染。要達到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對象采取不同的切實有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長。
    常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當選用。
    1、培養(yǎng)基用濕熱滅菌
    培養(yǎng)基在制備后的24小時內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。
    注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。
    關(guān)閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時，開始計時，維持壓力0.1-0.15MPa，20分鐘。
    按容器大小不同，保壓時間有所不同，見表。該表所列數(shù)字是徹底滅菌很保險的數(shù)字，如果容器體積較大，但是放置的數(shù)量很少，也可以減少時間。
培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必需的**少時間

容器的體積/mL	在121℃滅菌所需**少時間/min
20-50	15
75-150	20
250-500	25
1000	30

     到達保壓時間后，即可切斷電源，在壓力到0.5MPa，可緩慢放出蒸汽，應(yīng)注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。當壓力降到零后，才能開蓋，取出培養(yǎng)基，擺在平臺上，以待冷凝。不可久不放氣，引起培養(yǎng)基成分變化，以**培養(yǎng)基無法擺斜面。一旦放置過久，由于鍋爐內(nèi)有負壓，蓋子打不開，只要將放氣閥打開，大氣壓入，內(nèi)外壓力平衡，蓋子便易打開了。
    對高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種工具，可以延長滅菌時間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴格遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長時間。
     對于一些布制品，如實驗衣、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅局20-30分鐘。
     高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其PH值下降0.2-.3單位。高壓后培養(yǎng)基PH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿調(diào)高PH值**預(yù)定值的則相反。培養(yǎng)基中成分單一時和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時，高壓滅菌后的PH值變化幅度較大，甚**可大于2個PH值單位。環(huán)境PH值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。#p#分頁標題#e#
     高壓滅菌通常會使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0.43倍。
     培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。
     為防止高壓滅菌產(chǎn)生的上訴一些變化可用下列方法：
    （1）經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，以便及時采取有效措施。
    （2）設(shè)計培養(yǎng)基配方時盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意PH值對高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。
    （3）配制培養(yǎng)基時應(yīng)注意成分的適當分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在**后加入。
    （4）注意高壓滅菌后培養(yǎng)基PH值的變化及回復(fù)動態(tài)。如高壓滅菌后的PH值常由5.8升高**6.48。而96小時后又回降**5.8左右。這樣在實驗中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。
    2、用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌
    在無菌操作時，把鑷子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。
    3、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌
    干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180℃的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細菌的營養(yǎng)細胞的抗熱性大為提高，接近芽孢的抗熱水平，通常采用170℃持續(xù)90分鐘來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時應(yīng)漸進升溫，達到預(yù)定溫度后記錄時間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免防礙熱對流和穿透，到指定時間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費時間。
    4、不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌
    一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些微生物是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。
    一些化學成分在高溫高壓下回發(fā)生降解而失去效能或降低效能。經(jīng)高溫滅菌后赤霉素GA3的活性僅及不經(jīng)高溫滅菌的新鮮溶液的10%。蔗糖經(jīng)高溫后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，產(chǎn)生抑制培養(yǎng)的植物組織生長的物質(zhì)。高溫還可使碳水化合物和氨基酸發(fā)生反應(yīng)。IAA，NAA，2，4-D、激動素和玉米素在高溫下是比較穩(wěn)定的。維生素具有不同程度的熱穩(wěn)定性，但如果培養(yǎng)基的PH值高于5.5，則維生素B1會被迅速降解。泛酸鈣、植物組織提取物等要過濾滅菌，不能高溫滅菌，否則會失去作用。
    防細菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45微米以下，當溶液通過濾液后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置；液量小時，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。
    過濾除菌操作步驟：shou先將過濾器、接液瓶用紙包好，濾膜可放在培養(yǎng)皿內(nèi)用紙包好。使用前先經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘；在超凈工作臺上，將濾器裝置裝好，用滅菌無齒鑷子將濾膜安放在隔板上，濾膜粗糙面向上；然后將待除菌的液體注入濾器內(nèi)，開動真空泵即可過濾除菌。濾液經(jīng)培養(yǎng)證明無菌生長后可保存?zhèn)溆谩?br />     5、空間采用紫外線和熏蒸滅菌
   （1）紫外線滅菌   在接種室、超凈臺上或接種箱用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)很核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200-300nm，其中260nm的殺菌能力**強，但是由于紫外線的穿透能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2米為宜。
   （2）熏蒸滅菌  用加熱焚燒、氧化等方法，使化學藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。
    化學消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競爭其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細胞漿膜的通透性，使細胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時間越長，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強，但石炭酸和酒精例外。
    常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關(guān)閉緊密，按5-8ml/m³用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m³高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時，房間可預(yù)先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。#p#分頁標題#e#
    6、一些物體表面用藥劑噴霧滅菌
    物體表面可用一些藥劑涂搽，噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用75%的酒精反復(fù)涂搽滅菌，1%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%-1%的新潔爾滅也可以。
    7、植物材料表面用消毒劑滅菌
    從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基，便會造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接種到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體（explant)。
    shou先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當?shù)乃⒆拥人⑾础０巡牧锨懈畛蛇m當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘**數(shù)小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴重時特別有用。
    洗時可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖洗洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當然，**理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)吐溫。
    第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。有一些特殊的材料，如果實、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用70%酒精處理稍長的時間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。
    第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1-2種使用見下表。
常用滅菌劑使用濃度及效果比較表

滅菌劑名稱	使用濃度%	消毒難易	滅菌時間	滅菌效果
酒精	70-75	易	0.1-3	好
氯化汞	0.1-0.2	較難	2-10	**好
漂白粉	飽和溶液	易	5-30	很好
次氯酸鈣	9-10	易	5-30	很好
次氯酸鈉	2（活性氧）	易	5-30	很好
過氧化氫	10-12	**易	5-15	好
抗菌素	4-50mg/L	中	30-60	較好

    上述滅菌劑應(yīng)在使用前臨時配制，氯化汞可短期內(nèi)儲用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水漂洗3-4次即可；由于升汞液滅菌的材料，難以對升汞殘毒去除，所以應(yīng)當用無菌水漂洗8-10次，每次不少于3分鐘，以盡量去除殘毒。
    滅菌時，不瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時間，倒入消毒溶液，不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時間之前1-2分鐘，開始把消毒液傾入一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，氫凈后立即倒入無菌水，輕攪漂洗。滅菌時間是從倒入消毒液開始，**倒入無菌水時為止。記錄時間還便于比較消毒效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒材料。寧可多用些滅菌液，切勿勉強在一個體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。
    在滅菌溶液中加吐溫-80或Triton X效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸入到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時間，一般加入滅菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。
    **后一步是用無菌水漂洗，漂洗要求3分鐘左右，視采用的消毒液種類，漂洗3-10次左右。無菌水漂洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。#p#分頁標題#e#
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滅菌原理 
     紫外線滅菌的原理:紫外線滅菌是用紫外線管照射進行的。波長在220-300納米的紫外線稱為“殺生命區(qū)”，其中以260鈉米的殺菌力**強。紫外線作用于細胞DNA，使DNA鏈上相鄰的嘧啶堿形成嘧啶二聚體（如胸腺嘧啶二聚體），抑制了DNA復(fù)制。另外，空氣在紫外線照射下可以產(chǎn)生臭氧，臭氧也有一定的殺菌作用。紫外線透過物質(zhì)的能力很差，適用于空氣及物體表面的滅菌，與被照物的距離以不超過1.2米為易，照射時間以視紫外線燈管的功率大小、被照空間及面積大小，根據(jù)滅菌效果測定結(jié)果而定。由于紫外線對人體有傷害作用，因此，不要在紫外線燈照射下進行操作。
     氯化汞滅菌的原理：氯化汞也稱升汞，是一種劇毒的重金屬鹽殺菌劑，其殺菌的原理是Hg2+可與帶負電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細菌蛋白變性，酶失活。氯化汞使用濃度0.1%-0.2%，浸泡6-12分鐘時，就可以有效地殺死附著在外植體表面的細菌及真菌芽孢，滅菌效果極好。
但用氯化汞滅過菌的外植體材料要用無菌水反復(fù)多次洗滌（一般不少于5次），才可將殘留的藥劑除凈。使用氯化汞給環(huán)境造成污染，一般情況下，應(yīng)盡量用其它消毒劑滅菌，而以少用或不用氯化汞為易。
     次氯酸鈉滅菌的原理：次氯酸鈉又稱為“安替福民”，活性氧含量是0.8%,使用時稀釋3-5倍,浸泡外植體5-30分鐘,再用無菌水洗滌4-5次.它分解出具有殺菌作用的氯氣,滅菌后易于除去,不留殘余,殺菌力強,對植物材料無害,是植物組織培養(yǎng)常使用的殺菌劑之一。
     漂白粉滅菌的原理：漂白粉為白色粉末，一般含10%-20%（質(zhì)量/體積）的次氯酸鈣[Ca(ClO)2],使用時用飽和溶液，殺菌的原理在于它分解出具有殺菌作用的氯氣。氯與蛋白質(zhì)中的氨基結(jié)合，使菌體蛋白質(zhì)氧化，代謝功能發(fā)生障礙。注意漂白粉腐蝕金屬、棉織品，刺激皮膚，易吸潮散失有效氯而失效，平時要密封儲藏，**好現(xiàn)配現(xiàn)用，不要儲藏太久。
     酒精滅菌的原理：酒精具有較強的穿透力和殺菌力，它使細菌蛋白質(zhì)變性。使用的濃度一般為70%-75%。處理時間15-30秒，不宜太長，因為細胞容易收縮脫水。它具有浸潤和滅菌的雙重作用，適用于表面消毒，但不能達到徹底的滅菌，必須結(jié)合其它藥劑滅菌。
     為了提高乙醇的殺菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1%的酸或堿,以改變細胞表面帶電荷的性質(zhì)而增加膜透性,提高乙醇的殺菌效果。
     高錳酸鉀滅菌的原理：高錳酸鉀能使細菌酶蛋白中的基氧化成二硫基而失去酶活性。濃度稀釋時起氧化作用殺死細菌，日常生活中通常用作皮膚、果蔬的表面消毒劑，在一盆清水中加幾粒高錳酸鉀就可起到殺菌的作用。